本文采用hplc分析啤酒花浸膏中的葎草酮、合葎草酮、加葎草酮、蛇麻酮、合蛇麻酮和加蛇麻酮6种同系化合物,通过优化色谱条件,在等度洗脱条件下实现了其中两对难分离同分异构体的基线分离;收集这6种组分并对其进行了紫外(uv)光谱、红外(ir)光谱和质谱(ms)表征。
1液相色谱仪分析啤酒花浸膏中的 6 种酸性成分的实验部分
1.1仪器和药品
p230ii高压恒流泵,uv230ii紫外-可见波长检测器,zw色谱柱恒温箱;7725i手动进样阀(美国rheodyne公 司) ;finnigan液 相 色 谱-质 谱 联 用 仪(美 国thermo公司) ;tu-1810apc紫外-可见分光光度计;equinox55型傅里叶变换红外光谱仪(德国bruker公司)。
甲醇、乙腈、乙醇(色谱纯) ;磷酸(分析纯) ;实验用水由milli-q纯水系统(美国millipore公司)制备;啤酒花浸膏。
1.2样品制备
称取1.0056g浸膏于5ml离心管中,在30°c水浴中超声振荡,用30ml甲醇分多次将样品转移至50ml烧杯中,在水浴中超声振荡30min后转移至100ml容 量 瓶 中,用 甲 醇 定 容,充 分 混 匀。取19.0ml上述溶液于50ml容量瓶中,用甲醇定容,混匀,用0.45μm油膜过滤,滤液供分析。样品应在避光、低温条件下保存。
1.3分析条件
hplc条件:hypersilods2色谱柱(250mm×4.6mm,5μm) ,流动相为乙腈-0.1%(v/v)磷酸水溶液(ph2.2) (65∶35,v/v) ,流速为1.0ml/min,检测波长为315nm,进样量为20μl,柱温为室温。
uv光谱条件:样品用乙腈溶解,扫描波长范围为199~499nm。ir光谱条件:将样品与干燥的kbr粉末按1∶100的质量比混合,在玛瑙研钵中研磨压片,扫描范围为4500~500cm-1。
ms条件:电离方式为电喷雾电离(esi) ,离子源温度为150.00°c,检测器电压为3.05kv,质量扫描范围为m/z300.00~1000.00,一级全扫描质谱分析。
2液相色谱仪分析啤酒花浸膏中的 6 种酸性成分的结果与讨论
2.1色谱条件的优化
2.1.1磷酸的影响
以甲醇-水(含0.26%磷酸或磷酸调节ph为2.5)为流动相分析啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸为参考,考察了酸的加入对hplc分离啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸的影响。从图2a中可以看出,不加酸时色谱峰展宽,且严重拖尾,分离度低;加入0.1%(v/v)磷酸后目标物的出峰时间比不加酸时滞后了3~4min(见图2b) ,其原因可能是不加酸时啤酒花浸膏样品中的有效成分解离,以离子形式存在,在c18柱中保留相对较弱,导致出峰提前;加入酸使流动相的酸度增加,抑制了目标物在溶剂中的解离,使目标物峰的峰形得到改善,柱效增加,样品的分离度也明显提高。
2.1.2有机溶剂的影响
考察了分别以甲醇、乙醇及乙腈作为流动相中的有机相对啤酒花浸膏的hplc分离效果。从图3a可知,以甲醇作有机相时大保留时间大于350min,且组分2和3没有达到基线分离;从图3b可知,以乙醇作有机相时可分出4种组分,分别为合葎草酮(1)、葎草酮与加葎草酮合峰(2+3)、合蛇麻酮(4)、蛇麻酮与加蛇麻酮合峰(5+6) ,两对同分异构体都没有得到很好的分离;从图3c可知,乙腈的选择性相对较好,用其作有机相时柱压较小,且6种组分均得到了较好的分离,两对同分异构体的分离度(rs)分别为1.58和1.55,均实现了基线分离,故选择乙腈作流动相的有机相。
2.1.3温度的影响
在色谱分离中,色谱柱温度的改变会影响样品的分离度及保留时间,故有考察的必要。研究结果表明,温度每上升5°c,分离时间缩短约5min(以组分5计) ,两对同分异构体的分离度变化如表1所示。
柱温从室温(25°c)上升到35°c时,组分2和3及5和6的分离度分别下降12.7%和18.7%,分离度均低于1.5,不能达到基线分离的要求[12];温度上升到45°c时,组分5和6的分离度下降了约30%。温度的升高虽然使保留时间提前,但分离度相应地降低,使两对同分异构体的分离效果变差,不能达到基线分离,故选择柱温为室温。
2.2有效成分的制备与表征
2.2.1有效成分的制备
取1.2节中所制备的样品在*分离条件下进样,按出峰时间收集6种组分(合葎草酮、葎草酮、加葎草酮、合蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮) ,分别记为i、ii、iii、iv、v和vi。按1.3节所述的分析条件分别对收集的6个组分进行hplc分析,检测其纯度。通过面积归一化法测得6种组分的纯度分别为98.2%、94.3%、96.6%、93.2%、92.6%和90.2%。
2.2.2结构表征
(1)uv光谱:组分i的uv光谱如图4所示,其大紫外吸收波长(λmax)为227nm;从其余5种组分的uv光谱(图略)可见其λmax分别为222、222、323、321和323nm。在320nm左右有强的uv吸收带说明结构式中有3个共轭双键,且此处的吸收谱带说明还有外环羟基的作用。羟基是助色基团,其与苯环连接,形成n-π共轭导致其大吸收波张红移至220nm左右有大吸收波长;大于270nm处的谱带是由于结构式中的羰基的紫外吸收所致;在222nm、227nm处的吸收主要是由于六元环上的烯醇式-酮式互变作用引起。
(2)ir光谱:组分i的ir光谱见图5(其余5种组分的ir光谱图略)。该化合物在3412cm-1的吸收谱带是羟基的伸缩振动吸收峰;在2975~2840cm-1有3个强吸收谱带,说明分子内有甲基、次甲基、亚 甲 基 的c-h对称与不对称伸展振动;1467cm-1的谱带说明分子中含有甲基或乙基;1378cm-1处的吸收谱带证实有甲基存在;1525~1680cm-1处的一组谱带是六元环共轭体系c=c和邻 接c=o的 伸 缩 振 动 吸 收 区;1200~1000cm-1处的吸收带表示六元环上的碳氢面内的弯曲振动,说明环上有邻、间、对位取代基。该表征结果与其结构吻合。
(3)lc-ms:组分i的质谱图见图6,可以看出其准分子离子峰为m/z348.96;其余5种组分的准分子 离 子 峰 分 别 为m/z362.92、362.96、400.94、414.94、414.96,6种组分的分子式分别为c20h28o5、c21h30o5、c21h30o5、c25h36o4、c26h38o4、c26h38o4,ms表征结果与理论值一致。
通过uv光谱、ir光谱和ms对收集的6种组分进行表征,结果与其结构吻合,确认所收集的组分i为合葎草酮,ii为葎草酮,iii为加葎草酮,iv为合蛇麻酮,v为蛇麻酮,vi为加蛇麻酮。
3液相色谱仪分析啤酒花浸膏中的 6 种酸性成分结语
建立了hplc同时测定啤酒花浸膏中6种活性组分的方法,在等度洗脱下实现了两对难分离同分异构体的基线分离。该法具有简便、稳定、分离度好等优点,可用于啤酒花浸膏中酸性成分的分析。